簡介

肌動蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質，幾乎存在于所有真核細胞中。 它也是高度保守的蛋白質之一，與藻類和人類不同的物種相差不超過20％。 肌動蛋白是細胞中兩種細絲的單體亞基：細絲，細胞骨架的三個主要成分之一，以及細絲，是肌細胞中收縮裝置的一部分。 因此，肌動蛋白參與許多重要的細胞過程，包括肌肉收縮，細胞運動，細胞分裂和胞質分裂，囊泡和細胞器運動，細胞信號傳導，以及細胞連接和細胞形狀的建立和維持。

我們的鬼筆環肽綴合物選擇性地結合F-肌動蛋白。用于納摩爾濃度的鬼筆環肽衍生物是方便的探針，用于標記，鑒定和定量甲醛固定和透化組織中的F-肌動蛋白切片，細胞培養或無細胞實驗。鬼筆環肽比肌動蛋白更緊密地結合肌動蛋白絲單體，基本上導致肌動蛋白亞基從長絲末端解離的速率常數降低通過防止長絲解聚來穩定肌動蛋白絲。此外，發現鬼筆環肽可抑制鬼筆環肽F-肌動蛋白的ATP水解活性。鬼筆環肽在細胞中以不同濃度起作用不同。介紹時在低濃度的細胞質中，鬼筆環肽募集較少聚合形式的細胞質肌動蛋白和細絲蛋白進入聚集的肌動蛋白聚合物的穩定“島”，但它不會干擾應力纖維，即厚的束微絲。鬼筆環肽的性質是通過標記研究細胞中F-肌動蛋白分布的有用工具鬼筆環肽與熒光類似物并用它們染色肌動蛋白絲用于光學顯微鏡檢查。熒光衍生物鬼筆環肽已經證明非常適用于定位活細胞或固定細胞中的肌動蛋白絲以及用于定位肌動蛋白絲在體外可視化單個肌動蛋白絲。熒光鬼筆環肽衍生物已被用作該中的重要工具

肌動蛋白網絡的高分辨率研究。 AAT Bioquest提供各種熒光鬼筆環肽衍生物用于多色成像應用的不同顏色，如下表所示。

光譜特性

鬼筆環肽綴合物的激發和發射值總結在下表中

*由于其基本相同的光譜特性，優異地替代德克薩斯紅鬼筆環肽綴合物。

儲存和處理條件

熒光鬼筆環肽綴合物是DMSO中的1000X儲備溶液或凍干粉末。 如果儲存在-20°C，溶液和粉末應穩定至少6個月。 保護熒光共軛物免受光照，并避免凍/融循環。

注意：鬼筆環肽是有毒的，雖然小瓶中存在的**量只能對蚊子致死（鬼筆環肽的LD50 = 2 mg / kg），但應小心處理。

分析方案

簡要總結

在微孔板孔中準備樣品®

從板中的樣品中去除液體®

添加鬼筆環肽-iFluor?溶液（100μL/孔）®

在室溫下染色細胞20到90分鐘®

洗滌細胞®

在顯微鏡下檢查樣品

注意：將小瓶加熱至室溫并在打開前短暫離心

操作步驟

1. 制備1000 X鬼筆環肽DMSO儲備液：將30μLDMSO加入粉末形式的小瓶中。

2. 制備1X鬼筆環肽綴合物工作溶液：通過將1μL1000X鬼筆環肽綴合物DMSO溶液加入1mL含1％BSA的PBS中。

注1：鬼筆環肽綴合物的未使用的1000X DMSO儲備溶液應等分并儲存在-20℃，避光保存。

注2：不同的細胞類型可能染色不同。 應相應地制備鬼筆環肽綴合物工作溶液的濃度。

3. 染色細胞：

3.1進行甲醛固定。 在室溫下將含有3.0-4.0％甲醛的細胞在PBS中孵育10-30分鐘。

注意：避免使用任何含甲醇的固定劑，因為甲醇會在固定過程中破壞肌動蛋白。 優選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

3.2用PBS沖洗固定的細胞2-3次。

3.3可選：將0.1％Triton X-100在PBS中加入固定細胞（來自步驟2.2）3至5分鐘，以增加滲透性。 用PBS沖洗細胞2-3次。

3.4將100μL/孔（96孔板）的鬼筆環肽偶聯物工作溶液（來自步驟1）加入固定的細胞（來自步驟2.2或2.3），并在室溫下染色細胞20至90分鐘。

3.5用PBS輕輕沖洗細胞2至3次以除去過量的鬼筆環肽結合物，然后在顯微鏡下進行電鍍，密封和成像。

參考文獻

1. Mirko Messa, Rubén Fernández-Busnadiego, Elizabeth Wen Sun, Hong Chen, Heather Czapla, Kristie Wrasman, Yumei Wu, Genevieve Ko, Theodora Ross, Beverly Wendland, and Pietro De Camilli. Epsin deficiency impairs endocytosis by stalling the actin-dependent invagination of endocytic clathrin-coated pits. eLife Sci. 2014; 3:e03311.

2. Szczesna D, Lehrer SS (1993). The binding of fluorescent phallotoxins to actin in myofibrils. J Muscle Res Cell Motil, 14(6), 594.

3. Johnson S C, Nancy M. McKenna M N, and Wang Y (1988). Association of microinjected myosin and its subfragments with myofibrils in living muscle cells. J Cell Biol, 107(6), 2213.

4. Wang K, Feramisco JR, Ash JF (1982). Fluorescent localization of contractile proteins in tissue culture cells. Methods Enzymol, 85 Pt B, 514.

5. Miki M, Barden JA, dos Remedios CG, Phillips L, Hambly BD (1987). Interaction of phalloidin with chemically modified actin. Eur J Biochem 165, 125.

6. Cooper JA. (1987). Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J Cell Biol 105, 1473.