簡介

ReadiLink?快速抗體標記試劑盒提供了一種以微觀方式標記抗體的便捷方法。 該試劑盒僅需要兩個簡單的混合步驟而無需純化步驟。 試劑盒中使用的iFluor TM和mFluor TM染料的琥珀酰亞胺酯（SE）顯示出與蛋白質的脂族胺的良好反應性和選擇性，并形成羧酰胺鍵，其與天然肽鍵相同且穩定。 iFluor TM和mFluor-抗體綴合物可用于**熒光染色，熒光原位雜交，流式細胞術和其他生物學應用。 每個ReadiLink?Rapid抗體標記試劑盒都提供了進行兩次偶聯反應（2x50μg蛋白質）的所有必需成分。 每個試劑盒可用于標記50-100μg單克隆，多克隆抗體或其他蛋白質（> 10 kDa），只需兩個簡單的混合步驟。

Readilink?快速試劑盒標記原理

1.通過在反應緩沖液（pH 7.5-8.5）中將標記染料與蛋白質（待標記的）混合，開始標記反應。

2.孵育得到所需蛋白質綴合物和非反應性游離染料的混合物。

3.通過將非熒光Tide Quencher TM（TQ）染料與反應溶液混合來淬滅反應。 TQ染料阻止反應并將非反應性自由標記染料轉化為非熒光TQ標記染料復合物，這消除了游離標記染料的背景熒光干擾。

試劑盒組成

標準操作規程（標記50μg蛋白質）

將所有組分加熱并在打開前將樣品瓶短暫離心，并在開始結合前立即準備所需的溶液。 以下SOP是標記抗HDAC IgG抗體的實例。

1.準備蛋白質溶液（溶液A）：

為了標記50μg蛋白質（假設目標蛋白質濃度為1 mg / mL），將5μL（總反應體積的10％）反應緩沖液（組分B）與50μL目標蛋白質溶液混合。

注意1.如果蛋白質濃度不同，請相應調整蛋白質體積，使~50μg蛋白質可用于標記反應。

注2：為了標記100μg蛋白質（假設目標蛋白質濃度為1 mg / mL），將10μL（總反應體積的10％）反應緩沖液（組分B）與100μL目標蛋白質溶液混合。

注3：蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中;如果蛋白質溶解在甘氨酸緩沖液中，必須用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，10 kDa（來自Millipore的cat＃UFC501008）去除游離胺或銨鹽（如硫酸銨和乙酸銨）廣泛用于蛋白質沉淀。

注4：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩定的不純抗體或抗體不能很好地標記。

注5：如果蛋白質濃度低于1 mg / mL，結合效率會顯著降低。為獲得**標記效率，建議蛋白質濃度范圍為1-2 mg / mL。

2.運行結合反應：

2.1將蛋白質溶液（溶液A）加入一小瓶標記染料（組分A）中，通過反復移液幾次將其充分混合，或將小瓶渦旋幾秒鐘。

注意：使用標記染料的兩個小瓶（組分A）通過將100μg蛋白質分成2x50μg蛋白質并使每個50μg蛋白質與一小瓶標記染料反應來標記100μg蛋白質。 將兩個小瓶合并用于下一步。

2.2將綴合反應混合物在室溫下保持30-60分鐘。

注意：如果需要，可以旋轉或搖動綴合反應混合物更長的時間。

3.停止共軛反應：

3.1加入5uL（50μg蛋白質）或10μL（100μg蛋白質），這是TQ染色猝滅緩沖液（組分C）總反應體積的10％到共軛反應混合物中（來自步驟2.2），混合 他們很好。

3.2在室溫下孵育10分鐘。

3.3標記的蛋白質（抗體）現在可以使用了。

蛋白質共軛物的儲存

蛋白質綴合物應在載體蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL儲存。 為了更長時間的儲存，可以將蛋白質綴合物凍干或分成單次使用的等分試樣并在≤-20℃下儲存。

表1. AAT Bioquest ReadiLink?快速抗體標記試劑盒（2個標記/試劑盒，每個標記適用于50μg抗體）

參考文獻

1. Hermanson GT (1996). Biocojugate Techniques, Academic Press, New York. 2. Haugland RP (1995). Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Methods Mol Biol 45, 205-21.

3. Brinkley M (1992). A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking reagents. Bioconjugate Chem 3, 2-13.