1) 根據機器配置選擇*亮的熒光染料

        了解你使用的流式細胞儀的性能，大多數流式細胞儀有兩個或者多個激光器，有五種波長可供選擇：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、藍色（488 nm）、黃色（561 nm）和紅色（640 nm）。除了激光器，具體的慮光片和檢測器也決定了你的配置可同時檢測多少種顏色。

        多色標記熒光染料盡量選用不同激光激發的染料。熒光染料在同一激光激發的染料中選擇時，優先選擇亮度高的染料，以保證*佳分辨率。常用的高亮度染料有PE、PE/Cy5、PE/Cy7、APC、PerCP/Cy5.5、AlexaFlour 647等，但是并不是說染料亮度高，在您的流式細胞儀上就能獲得較好的信號，這還需要您的儀器的配備合適的激光、濾光片和探測器。

2) 平衡抗原表達水平和染料熒光亮度

        在單色流式檢測實驗中，我們通常會選擇亮度*強的幾種染料，如PE、APC等等。但是，在多色流式檢測時，有時因為顏色的限制不得不用到一些亮度較暗的染料。為了保證每個通道的分辨率可接受，我們需要合理搭配抗原和染料。一般來說，較暗的染料，如FITC、PerCP等，優先分配給表達量高的抗原，而PE、APC、PerCP/Cy5.5、PE/Cy5等較亮的染料可以分配給表達量低或者分辨率要求比較高的抗原。合理配色的*終結果是讓不同表達水平的抗原檢測到的信號盡量均衡。

3) 保證搭配熒光染料的質檢發射光譜重疊度盡量小

        如前所述，當兩種熒光染料的發射光譜重疊時，它們的熒光信號將會互相干擾，給數據分析帶來麻煩。雖然熒光補償技術可以將干擾扣除，但補償值越大，補償后的信號分辨率會降低越厲害。*好選擇很少或者沒有重疊的熒光基團，以*大限度減少這種滲漏。不同激光激發的染料是優選，如PE和APC，但在某些情況下，這可能與盡量選擇亮的熒光素的規則是沖突的。如在進行四色分析時，經常會將PE-Cy5標記的抗體與APC標記的抗體搭配使用。因為Cy5的激發波長與APC的激發波長相近，所以PE-Cy5與APC均可被紅色激光（640nm）所激發，而兩者的發送光譜也比較接近，導致PE-Cy5與APC的顏色補償很難調整。相反，由于PE-Cy5.5中的Cy5.5激發波長為675nm，不能被紅色激光器所激發，也就不存在Cy5.5對APC的干擾，所以用PE-Cy5.5對APC計劃沒有串色。因此，可能需要犧牲個別熒光染料的亮度來避免熒光滲漏以及分辨率下降。

4) 盡量避免偶聯熒光染料使用帶來的假陽性