今天百螢生物帶您了解一種可以檢測晚期細胞凋亡中DNA片段的方法。隨著科學的進步，人們發現多細胞生物由高度有組織的細胞群組成，而重要的是多細胞生物擁有復雜的細胞過程，如細胞增殖和細胞凋亡建立穩態。任何一個過程的不適當轉變都會導致**。例如，神經元中細胞凋亡活性的增加是各種神經退行性**如阿爾茨海默氏病和帕金森病的根源。相反，細胞凋亡機制的喪失可導致過度的細胞生長，這是細胞如何變成癌癥的潛在機制?？傮w而言，細胞凋亡在**中的作用是一項很熱門的科學研究。

細胞凋亡是復雜且精心編排的程序性細胞死亡的途徑。這種細胞自主過程的特征在于幾種不同的形態學和生物化學標記，包括細胞和核收縮，染色質濃縮，細胞質膜起泡和核DNA片段化。這些形態變化都源于兩種凋亡途徑：外在或內在途徑。外在途徑是由細胞外死亡受體配體（例如腫瘤壞死因子（TNF）或Fas配體（FasL））激活的受體介導的途徑。內源性途徑由環境應激物在細胞內誘導，導致線粒體膜透化和凋亡誘導因子（AIF）和細胞色素c的釋放。來自兩種途徑的信號通過caspase級聯反應，*終導致caspase激活的蛋白酶下游消化DNA。細胞凋亡的這些特征允許使用DNA片段化測定法作為鑒定細胞凋亡的*終決定因素。

圖1.概述了細胞凋亡中涉及的所有參數。這些事件的發生是無序的，它們中的許多將重疊并且經常同時發生。事件1至4是細胞凋亡的生物化學特征，其不一定以細胞死亡結束。下游細胞凋亡事件5至8是細胞已經致力于細胞凋亡的強有力指標，之后細胞不太可能存活。

1 膜不對稱性喪失                                                             5 G1細胞周期亞群增加

2 促凋亡Bcl-2蛋白的激活                                                6 核固縮

3 caspase激活                                                                 7 DNA片段化

4 線粒體膜電位的喪失和細胞色素c的釋放                        8 細胞膜破裂

檢測DNA片段化的凋亡檢測

有各種技術用于評估和鑒定凋亡DNA片段化。*早的測定是基于凝膠的DNA梯度測定，其涉及使用瓊脂糖凝膠電泳來可視化和分離DNA片段。細胞凋亡的DNA片段化由一種獨特的“梯狀”模式表示，核小體片段的長度約為180-200個堿基對。盡管有效地生成定性數據，但該技術不易適應高吞吐量使用。

另一種檢測方法采用雙抗體夾心ELSIA試驗，該試驗由抗DNA和抗組蛋白抗體組成，以在凋亡過程中顯現DNA片段化。盡管該測定法在檢測凋亡DNA片段方面明顯更敏感并且適合于高通量用途（例如化合物篩選），但是它是勞動密集型的并且抗體的使用是昂貴的。

TUNEL分析

1992年，Gorczyca等人。1992年引入了一種利用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）和切口平移或TUNEL測定法測量細胞凋亡DNA片段化的新方法。TdT催化熒光團標記的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）加入到DNA雙鏈斷裂（DSB）的3'-羥基末端。

自引入TUNEL試驗以來，它已成為一種廣泛接受的原位技術，用于鑒定凋亡細胞死亡。與以前的方法相比，TUNEL分析更靈敏，能夠在幾個數量級上進行廣泛的定量測量。多年來，TUNEL技術已針對生色和熒光檢測方法進行了調整和優化。顯色TUNEL測定利用與生物素綴合的dUTP和酶標記的鏈霉抗生物素蛋白進行高靈敏度染色。熒光檢測方法依賴于熒光染料偶聯的dUTP，其用于直接檢測DNA片段化。

幾個變量影響TUNEL測定的染色動力學。這些變量中的一些包括試劑濃度，樣品固定和DNA鏈斷裂的可及性，其可在組織或細胞樣品類型之間變化。因此，標準化您選擇的TUNEL檢測并進行適當的控制對于數據收集和解釋至關重要。

Cell Meter?TUNEL細胞凋亡檢測

AAT Bioquest的Cell Meter?TUNEL細胞凋亡檢測針對熒光檢測進行了優化，可提供綠色或紅色熒光發**色。AAT Bioquest的Cell Meter?Assays包括所有必需成分和強大的方案，用于檢測和定量細胞中的凋亡DNA片段化。通過使用TdT將熒光染料修飾的脫氧尿苷5'-三磷酸核苷酸Tunnelyte TM Green或Tunnelyte TM Red催化摻入DNA的3'OH末端來實現測量凋亡DNA片段。然后可以通過流式細胞術定量標記的DNA片段或通過熒光顯微鏡直接觀察。

圖2.用誘導細胞凋亡的化學物質，星形孢菌素（SS）處理的HeLa細胞中TUNEL反應的熒光圖像。與未處理的對照相比，用100nM或1μMSS處理HeLa細胞4小時。將細胞與反應混合物在37℃溫育1小時。使用具有FITC濾光器組的熒光顯微鏡分析綠色熒光信號。熒光標記的DNA鏈斷裂在SS處理的細胞中顯示出強烈的熒光染色。

Tunnelyte?Green在497 nm處的峰值吸收非常適合配備488 nm氬離子激光器的儀器進行高效激發。使用氦氖激光器的儀器可有效激發Tunnelyte?Red在547 nm處的峰值吸收。對于發射濾光片選擇，可分別使用FITC（530/30）或Cy5（660/40）濾光片讀取Tunnelyte?Green或Tunnelyte?Red。由于Tunnelyte?核苷酸與藍色光譜充分分離，因此DAPI，Hoechest或Nuclear Violet?LCS1等染色劑適用于多色熒光應用中的活細胞復染。

圖3.Tunnelyte?Green的吸收和發射光譜。激發波長為488nm（藍色激光線）。Tunnelyte?綠色讀數帶有發射濾光片FITC（綠色波段）。

圖4：Tunnelyte?Red的吸收和發射光譜。激發波長為561 nm（綠色激光線）。使用發射濾光片Cy5（紅色波段）讀取Tunnelyte?紅色。

我們的Cell Meter?TUNEL細胞凋亡檢測與其他市售TUNEL檢測相比具有明顯的優勢，因為我們的試劑盒在反應緩沖液中不含有二甲胂酸鈉或鉀。消除二甲胂酸鈉具有雙重益處。首先，處理起來要**得多。其次，它提供了更靈敏和準確的細胞凋亡檢測。二甲胂酸鈉是一種致癌的砷衍生物，通過攝入，吸入或皮膚接觸而具有高毒性。

實驗流程

用測試化合物制備細胞

用4％甲醛固定細胞

用37℃的反應混合物孵育1小時

洗滌并在Ex / Em = 550/590 nm處分析細胞

注意：在室溫下解凍組分C，使用前將組分A和B保存在冰上。

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AAT Bioquest的Cell Meter?TUNEL檢測試劑盒為檢測細胞凋亡DNA片段提供了一種簡單，**且靈敏的方法。熒光核苷酸的直接摻入通過減少所需的孵育步驟數量來減少測定時間，這允許更快地標記片段化DNA。*后，我們的試劑不含二甲胂酸鈉，這使得我們的TUNEL實驗產生的廢物更容易處理。

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