1.為什么我的總NAD / NADH讀數與我的各個NAD / NADH讀數的總數不匹配？ 

答：導致這種情況的*可能原因是NADH提取物讀數不準確。根據初始NAD濃度，NADH提取液可能無法從樣品孔中消除所有NAD，這意味著某些NAD將保留并混淆讀數。考慮到檢測探針是高度敏感的，即使很小的殘留NAD也會影響熒光測量。這就是為什么我們建議用戶測量總NAD / NADH和NAD提取物的原因。然后從那里可以將NADH濃度計算為總NAD / NADH減去NAD提取物。通常，這將對濃度以及NAD / NADH比值進行更準確的測量。

2.Amplite?熒光NAD / NADH比率測定試劑盒*紅色熒光*是否可以與NADP / NADPH一起使用？該試劑盒可以測量NADP +和NADPH嗎？

答：不，此套件無法測量NADP / NADPH。但是，我們確實提供了另一種試劑盒，可以定量NADP / NADPH比率。參見Amplite?熒光NADP / NADPH比率檢測試劑盒*紅色熒光*

3.Amplite?熒光NAD / NADH比率測定試劑盒*紅色熒光*是否可用于植物細胞？**細胞？哺乳動物細胞？用于組織樣本？

答：是的，該試劑盒可用于植物，**，哺乳動物和組織細胞樣品。每種細胞類型的制備指南如下：

植物細胞樣品：

用200 mg / mL的裂解緩沖液勻漿葉子，并以2500 rpm離心5-10分鐘，使用上清液進行測試。

**細胞樣品：

離心收集**細胞（（10,000 g，0°C，15分鐘）。使用約100至1000萬個細胞/ mL裂解液，將處理過的溶液在室溫下放置15分鐘，以2500 rpm離心5分鐘后，用上清進行測試。

哺乳動物細胞樣品：

從板孔中除去培養基，每1-5百萬個細胞使用約100 μL裂解緩沖液（或在96孔細胞培養板中為50-100 μL /孔），并將處理過的溶液在室溫下放置15分鐘。直接使用細胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘，將上清液用于測試。

組織樣品：

稱量約20 mg組織，用冷PBS洗滌。在微量離心管中用400 μL裂解緩沖液勻漿。以2500 rpm離心5-10分鐘，將上清液用于測定。

4.Amplite?熒光NAD / NADH比率測定試劑盒*紅色熒光* pH敏感嗎？我是否必須在特定的pH緩沖液中準備樣品？pH值會影響我的熒光讀數嗎？

答：pH是NAD或NADH萃取步驟中的一個因素。NADH提取步驟（和相應的緩沖液，組分D）是堿性的（pH> 7），而NAD提取步驟（和相應的緩沖液，組分E）是酸性的（pH <7）。此外，與大多數熒光探針一樣，我們的NADH傳感器對pH敏感。讀數應在中性條件下（pH≈7）進行。

5.典型的NAD與NADH比率是多少？

答：在哺乳動物細胞中，總NAD / NADH比率通常被引用為10：1，而游離細胞質NAD / NADH比率估計約為725：1。

6.NADH和ROS是否相關？

答：活性氧（ROS）是涉及氧化還原反應的多種細胞途徑的潛在破壞性生化副產物，其中*主要的貢獻者是輔酶NAD +和NADP促進的能量途徑。這些輔酶的還原形式用于ROS的**，各種ROS本身以臨時方式用于細胞內和細胞間信號傳導。目前在細胞中約有 400個已知的涉及NAD + / NADH的氧化還原反應，另外約30個涉及磷酸化的NADP / NADPH的氧化還原反應。這些分子的深遠影響使得它們的測量和可視化即使在看似無關的實驗中也很有用

7.如何為Amplite?熒光NAD / NADH比分析試劑盒*紅色熒光*制備/裂解細胞樣品？

答：提供了裂解緩沖液（組分G）。您可以使用《細胞樣品制備方案》中概述的樣品制備指南。

8.我能在不裂解細胞的情況下測量NADPH嗎？

答：大多數傳統的印跡和蛋白質檢測方法都涉及細胞裂解物，但近年來，已開發出新的探針，可以可視化活細胞中NADP + / NADPH的水平。細胞內探針將使研究人員無需進行細胞裂解步驟即可進行測量。對于多參數實驗，請選擇處于極端波長的熒光團，以減少光譜重疊和數據校正的必要性。

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