Screen Quest 熒光法葡萄糖攝取檢測試劑盒是美國AAT Bioquest生產的用于葡萄糖檢測的試劑盒，葡萄糖轉運系統負責將葡萄糖轉運穿過細胞膜。測量組織和細胞中2-葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖（2-DG）的攝取被廣泛接受作為估計葡萄糖攝取量和研究葡萄糖代謝的調節和胰島素抗性機制的可靠方法。 2-DG攝取通常通過使用用氚或C14標記的非代謝的2-DG來確定。然而，常規使用放射性標記的探針是昂貴的并且需要繁瑣的特殊處理程序。 AAT Bioquest的Screen Quest 熒光葡萄糖攝取分析試劑盒可在細胞中提供靈敏的非放射性分析。在該測定中，2-DG被葡萄糖轉運蛋白吸收，并代謝成2-DG-6-磷酸（2-DG6P）。不可代謝的2-DG6P在細胞中積累，并且與細胞的葡萄糖攝取成比例。累積的2-DG6P被酶促氧化并產生NADPH，其通過熒光NADPH探針特異性監測?？梢酝ㄟ^熒光酶標儀讀取信號。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供上等的Screen Quest 熒光法葡萄糖攝取檢測試劑盒。 

樣品實驗方案

簡要概述

1.平板細胞并根據需要處理細胞
2.加入10μL/孔2-DG并在37℃下孵育20-40分鐘
3.洗滌細胞并裂解細胞
4.加入50μl/孔的2-DG Uptake Assay工作溶液
5.在室溫下孵育30至120分鐘
6.監測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光增加

溶液配制

1.儲備溶液配制

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。 避免反復凍融循環。
KRPH緩沖液原液（1X）：
將20mL KRPH緩沖液（5X）（組分H）加入到80mL去離子水中并充分混合。 注意：對于大約一個96孔板，50 mL體積的1×KRPH緩沖液就足夠了。 按比例準備所需的音量。 將未使用的1×KRPH存放在4oC或-20oC。

2.工作溶液配制

1. NADP工作溶液：
將100μLH2O加入到NADP（組分G）的小瓶中并充分混合。

2.酶探針工作溶液：
將5mL測定緩沖液（組分F）加入酶探針瓶（組分E）中并充分混合。

3. 2-DG攝取分析工作溶液：
將100μL的NADP工作溶液加入酶探針工作溶液中并充分混合。 注意：這些數量適用于一個96孔板。

操作步驟

重要提示：該方案可用作培養3T3-L1脂肪細胞用于2-DG攝取的指導。

1.在生長培養基中以50,000-80,000細胞/孔/100μL/ 96孔或12,500-20,000細胞/孔/25μL/ 384-孔黑壁/透明底細胞培養Poly-D賴氨酸平板培養4-6小時。

2.從培養箱中取出細胞板，從孔中吸出培養基，用100μl/孔（96孔板）或25μl/孔（384孔板）無血清培養基除去細胞。將細胞在37oC，5％CO2培養箱中孵育6小時至過夜。

3.從培養箱中取出細胞板，從孔中吸出培養基，用100μL/孔1×KRPH緩沖液輕輕洗滌細胞兩次。

4.加入90μL/孔葡萄糖攝取緩沖液（組分B）并在37℃，5％CO2培養箱中孵育細胞1小時。

5.用或不用胰島素或試驗化合物刺激20分鐘。加入10μL/孔的10×胰島素溶液至終濃度為1μM或10×化合物測試溶液。并且還向未處理的孔中加入10μL胰島素載體緩沖液或復合載體緩沖液作為對照，并在37℃，5％CO2培養箱中孵育20分鐘。

6.對于葡萄糖攝取抑制研究，加入10×Phloretin至終濃度為200 uM或測試抑制劑，并在37oC，5％CO2下孵育2-5分鐘。注意：建議將10mL抑制劑載體緩沖液加入胰島素處理和未處理的孔中作為對照。 Phloretin處理的細胞可用作陽性對照。

7.向每個孔中加入10μL/孔2-DG溶液（組分A），并在37℃，5％CO2培養箱中孵育20-40分鐘。對于陰性對照，留下一些未經胰島素，抑制劑和2-DG處理的孔。

8.處理后，取出每孔中的溶液，用KRPH緩沖液輕輕洗滌細胞3次，100μL/孔，從溶液中除去額外的2-DG。從孔中移除KRPH緩沖液。

9.向每個孔中加入25μL/孔酸性裂解緩沖液（組分C），并在37℃下孵育20分鐘以裂解細胞。并且可以同時制備2DG攝取測定混合物。

10.向每個孔中加入25μL/孔中和緩沖液（組分D），充分混合，在室溫下放置5-10分鐘以中和細胞裂解物。

11.向2DG6P標準品或細胞裂解液的每個孔中加入50μL2DGUptake Assay工作溶液。

12.在室溫下孵育反應30分鐘至2小時，避光。

13.用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的熒光板讀數器監測熒光增加（Ex / Em = 540 / 590nm，在570nm處截止）。